撰文｜风

肿瘤免疫疗法开启肿瘤治疗的新篇章。肿瘤免疫研究的是在维持自身耐受条件下特异性靶向肿瘤细胞，其目标是结合免疫效应和免疫记忆消除肿瘤及其转移并防止复发。现阶段的肿瘤免疫疗法包括免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade，ICB）、CAR-T细胞过继（）以及细胞因子（）等。适应性免疫细胞包括T细胞和B细胞。根据TCR的不同，CD3+T细胞分为αβ T细胞和γδ T细胞。γδ T细胞在人外周血约占CD3+T细胞的1-5%，在肠道和皮肤的比例则增加到10%-50%。现代肿瘤免疫学起源于B细胞研究，尤其是抗体介导的保护效应和分型。尽管B细胞研究已经相当深入（），但仍存在两个缺陷：1. 肿瘤内具有抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）的细胞稀少。2. 可以区分正常细胞和肿瘤细胞的抗体靶点较少。这些缺点可以被细胞毒T细胞（cytolytic T lymphocyte，CTL）解决。在肿瘤细胞内，基因组不稳定诱导突变产生新生抗原引起αβ T细胞介导的免疫应答。肿瘤浸润T淋巴细胞（tumor infiltrating T lymphocytes，TILs）通过MHC分子呈递的新生抗原识别靶细胞并诱导死亡。然而，这个过程也存在缺陷：1. 许多肿瘤细胞可利用突变较少。2. 部分肿瘤细胞下调β2-微球蛋白，减少抗原呈递。3. TILs上调免疫检查点抑制受体，如 PD-1和CTLA-4。为此，研究人员基于B细胞和T细胞开发CAR-T细胞疗法，同时赋予其抗体特异性和溶细胞作用。尽管CAR-T在血液相关肿瘤取得变革性治疗效果，但现实的挑战仍然存在，例如有限的抗原靶点、T细胞脆性和T细胞扩增和转导的耗时等。为了应对这些挑战，具有独特生物学特性的γδ T细胞逐渐获得研究人员青睐。目前，基于γδ T细胞的临床试验尽管依然有问题存在，但已经取得不错的进展。

近期，英国伦敦国王学院弗朗西斯克里克研究所Bruno Silva-Santos研究团队在Science杂志在线发表题为Cancer immunotherapy by γδ T cells的综述文章。该综述总结γδ T细胞不同亚群在治疗中的抗原识别和免疫治疗临床试验，强调其在连接固有免疫和适应性免疫的独特优势可以在肿瘤免疫中的扮演关键角色，并揭示γδ T细胞在肿瘤免疫治疗中的广阔应用前景。

γδ T细胞：一种天然CAR-T细胞

γδ T细胞具有CAR-T细胞特性，适合免疫治疗。首先，γδ TCR可以识别天然抗原，且γ肽段的V-D-J基因重组赋予其较为广泛的受体多样性，包括多种肿瘤细胞表面高表达自体抗原和构象转变抗原。值得一提的是，进化数据提示γδ T和B细胞存在生物学重叠，在缺少γδ T的蜥蜴中，B细胞增多，而在具有γμ TCR的有袋动物中，B细胞减少。其次，γδ T细胞功能多样，包括穿孔素和颗粒酶介导的溶细胞作用、NKRs介导的肿瘤细胞识别、ADCC作用和类似固有免疫细胞的快速反应能力和抗原提呈作用（图1）。因此，这种同时兼具固有免疫和适应性免疫的能力赋予γδ T细胞免疫治疗的独特优势。

图1：图片引用（1）

现成品治疗

基于αβ T细胞的CAR-T治疗分为自体移植和同种异体移植。自体移植周期较长，而同种异体移植面临移植物抗宿主反应（graft-versus-host disease，GvhD）风险。由于γδ T细胞没有MHC限制性，因此γδ T细胞的免疫治疗极少发生GvHD，使得基于同种异体移植的γδ T免疫治疗产品制备更为方便。另外， CAR-T治疗可以通过降低细胞MHC分子隐藏自身以降低宿主抗移植物反应，这对于多能干细胞来源的γδ T细胞来说容易做到。因此，γδ T细胞的细胞制备操作更为简洁，有利于大规模应用。

Vγ9Vδ2 T 细胞的肿瘤细胞识别和免疫治疗

在人体中，Vγ TCR链有7种（Vγ2、3、4、5、8、9和11），Vδ TCR链有4种（Vδ1、2、3和5）。其中，Vδ2主要与Vγ9构成TCR。Vγ9Vδ2 T细胞是血液中主要的γδ T细胞亚群，占γδ T细胞的50-95%。Vγ9Vδ2 T细胞识别磷酸抗原（phosphoantigens，pAgs），包括异戊烯焦磷酸（isopentenyl pyrophosphate，IPP）、羟甲基丁2烯 焦 磷 酸（hydroxymethyl-but-2-enyl pyrophosphate，isopentenyl pyrophosphate，HMBPP）和二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）。病毒感染细胞或肿瘤细胞由于失调的甲羟戊酸代谢途径而上调pAgs水平。pAgs并不直接结合Vγ9Vδ2 TCR，而是作为分子胶水粘合BTN3A1和BTN2A1形成二聚体，进而被Vγ9 TCR识别和结合，导致Vγ9Vδ2 T细胞的活化（）。

多种天然和合成pAgs用于体外扩增和活化γδ T细胞。溴醇焦磷酸（bromohydrin pyrophosphate，BrHPP）可以在体外扩增Vγ9Vδ2 T细胞，但体内药代动力学较差。氨基双磷酸盐（amino bisphosphonates，ABPs），例如唑来磷酸和帕米磷酸，在细胞内显著增加IPP含量。由于ABPs已经在临床治疗骨质疏松和溶骨肿瘤转移，因此用于活化Vγ9Vδ2 T细胞的治疗容易获得审批。尽管安全，但效果欠佳，这可能与慢性刺激导致的Vγ9Vδ2 T细胞耗竭相关。这些缺点并不能掩盖Vγ9Vδ2 T细胞的潜能。令人兴奋的是，ICB联合治疗释放Vγ9Vδ2 T细胞抑制的效果。广州复大肿瘤医院的一项I期临床试验使用同种异体Vγ9Vδ2 T细胞治疗肝癌和肺癌患者。美国In8Bio公司同样使用同种异体Vγ9Vδ2 T细胞治疗白血病。前期结果均显示良好的效果和安全性。值得一提的是，In8Bio公司开发一种名为耐药免疫疗法的创新性方法。具体来说，从脑胶质瘤分离的Vγ9Vδ2 T细胞经唑来磷酸和IL-2扩增后转导甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（methylguanine DNA methyltransferase，MGMT）基因赋予其化疗药物替莫唑胺抵抗性。另外，替莫唑胺可以上调肿瘤细胞NKG2DL使得免疫治疗更为敏感。转导MGMT的Vγ9Vδ2 T细胞可以联合替莫唑胺治疗发挥更好的治疗效果，且已经进入临床试验。除了过继细胞治疗（adoptive cell transfer therapy，ACT），基于抗体的衔接器也被应用于体内对抗细胞耗竭，以激活和扩增Vγ9Vδ2 T细胞。法国ImCheck Therapeutics公司开发BTN3A特异性激动抗体代替pAgs激活TCR，并已经进入临床试验。同样，识别肿瘤特异性抗原和Vγ9 TCR的双特异性抗体也在开发中，靶点包括血液肿瘤的CD123和CD40，实体瘤的EGFR等。研究显示ACT和抗体衔接器可以联合治疗肿瘤，例如Acepodia公司的Vγ9Vδ2 T细胞联合CD20抗体治疗。还有一种方案，研究人员将Vγ9Vδ2 TCR转导αβ T细胞构建CAR- Vγ9Vδ2细胞以利用其MHC非限制识别和强大抗肿瘤能力，数据显示这种方案确实有效但还需要密切关注不良反应。

表1

Non-Vγ9Vδ2 T 细胞的肿瘤细胞识别和免疫治疗

除了Vγ9Vδ2 T细胞，人外周血也存在Vδ1、3和5 T细胞，但这些往往富集在组织内，如肠上皮、皮肤、肝脏和脾脏等。由于Vδ1与Vδ3和Vδ5在生物学上的相似性，研究者统称为non-Vγ9Vδ2 T细胞。不同于Vδ2 主要与Vγ9形成TCR，Vδ1与Vγ链的结合较为灵活。测序分析表明Vδ1细胞存在克隆扩增和免疫记忆，显示适应性免疫应答特征。Vδ1 T细胞的抗原识别依赖于TCR和NKG2D。Vδ1细胞TCR主要参与识别MHC相关蛋白A和B（MICA/B）和MHC样分子，包括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、Annexin A2和MR1。Vδ1细胞NKG2D识别MICA/B和ULBP。晶体结构分析发现αβ T和γδ T细胞TCR与配体结合模式的不同。αβ TCR与MHC、CD1和MR1以“端对端”方向结合，而γδ TCR与配体以“底部”和“侧边”方向结合。这样的结合方式的区别可能反应信号转导强度的不同，因此并不能简单将γδ T细胞视作装配非传统TCR的αβ T细胞。临床最好的使用方案应基于γδ TCR信号转导以及NKRs和细胞因子等其他信息的整合效果引起的活化、扩增、归巢和效应功能等。另外，一些新的配体也逐渐揭示（表1）。例如 EPCR和EphA2，在多种肿瘤细胞由于AMPK或氧化应激等信号紊乱而过表达。CRISPR-Cas9技术鉴定HLA-DR作为γδ TCR的配体。因此，研究者推断许多非多态性MHC分子可能扮演“应激抗原”的基本角色，以通过γδ T细胞依赖的以及新生抗原非依赖的方式行使免疫监视的功能。

Vδ1细胞应用于肿瘤治疗得益于其数量和活化与多种实体瘤的无进展生存之间的强相关性，如肝癌、乳腺癌、肺癌和结肠癌。在结肠癌肝转移中，Vδ1细胞构成最大的TIL细胞群，并表现出强大I型抗肿瘤效应功能。目前存在多种体外临床级别的方案扩增Vδ1细胞。例如，Delta One T（DOT）方法可以在2-3周内实现1000倍扩增且同时上调NKR表达。这些DOT细胞在人源急性髓系白血病肿瘤异种移植模型中表现出良好的效果。西班牙Onechain Therapeutics公司则以Notch活化CD34+干细胞作为ACT治疗Vδ1细胞来源。另外，DOT细胞也适用于CAR技术，如靶向CD123、CD20和glypican-3等。美国Adicet Bio公司开发同种异体CD20 CAR-Vδ1细胞治疗B细胞肿瘤已经开始I期临床试验。最近，Adicet Bio公司也被批准CD27 CAR-Vδ1细胞治疗肾细胞癌的I期临床试验。另外，美国Luminary Therapeutics公司开发BAFF CAR-Vδ1+Vδ2混合细胞群治疗多发性骨髓瘤。

ICB与常态感知

事实上，传统观点认为ICB主要作用于肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）中的αβ T细胞发挥作用，然而最近研究显示γδ T细胞也是ICB的靶细胞。例如Vδ1细胞被认为在PD-1单抗治疗MHC-I缺陷结肠癌中发挥作用的细胞（）。这些发现为基于γδ T细胞免疫治疗实体瘤早期即开始标准ICB治疗提供一线证据。值得一提的是，PD-1+ Vδ1 T细胞与耗竭性αβ T细胞的基因表达特征并不一致，其可以在去抑制时迅速产生强大效应功能（）。

局部浸润γδ T与正常组织的识别称为“常态感知（normality sensing）”，这对于肿瘤治疗有独特启示。首先，γδ TCR与正常细胞识别介导的信号转导促进效应功能，但这并不会导致适应性配体识别触发的效应性功能，如细胞毒和炎性细胞因子。其次，γδ TCR激动剂可以模拟固有配体识别进而维持γδ T细胞能力，这有可能解决免疫功能持久问题。另外，常态感知γδ T细胞有助于组织完整性和限制炎症，进而参与组织损伤修复。这与一些认为肿瘤是一种不能修复的损伤概念有提示作用。最后，通过积极区分正常细胞与肿瘤细胞，γδ TCR天然创造治疗窗口以限制正常组织攻击。

治疗窗口和激活阈值的再思考

对于免疫治疗来说，治疗窗口等同于正常组织耐受。由于γδ T细胞关注自身抗原，这对于γδ T细胞显得尤其重要。αβ T细胞免疫治疗的“亲和力越高越好”可能并不适用于γδ T细胞，这可能引起错误地靶向正常细胞。γδ T细胞的耐受可以通过设置阈值以限制细胞活化来实现，具体的阈值包括包括TCR的配体密度、NKRs的配体密度、共刺激受体的配体密度、细胞因子、BTNL表达量和抑制性受体的配体表达（图2）。为了实现治疗效果的优化，需要鉴定哪些阈值促进不同肿瘤中γδ T细胞的辨别力。空间转录组可能在未来更好地理解γδ T细胞如何整合信号以促进不同表型。

图2

取得适当免疫治疗表型

上述提及的内容均是γδ T细胞的抗肿瘤效应。然而，研究显示IL-17A+γδ T细胞具有肿瘤促进作用。此外，在胰腺癌中，γδ T细胞的活化与肿瘤进展相关。小鼠实验表明γδ T细胞保护早期结肠癌，而IL-17A+γδ T细胞促进晚期结肠癌生长。因此，在评估用于临床ACT的γδ T细胞激活方案时，IL-17A的表达筛选是常见的。有趣的是，CD8+T细胞也存在这种悖论，小鼠研究揭示除了CD8+T细胞的细胞毒作用，也存在促肿瘤CD8+T细胞，其特征性表达IL-17和双调蛋白。类似的，双调蛋白表达γδ T细胞也存在于结肠癌中。这促进临床使用培养γδ T细胞时注意避免双调蛋白的诱导。

迈向治愈：持续的免疫协调

关于CAR-T细胞治疗的最重要参数是初始影响还是长期维持存在争论。如上所述，γδ T细胞可能同时满足这两种需求，一方面具有迅速反应能力，另一方面克隆性扩增可以维持长期免疫监视效应。因此，γδ T细胞疗法的主要实践目标是递送这种结合。值得注意的是，γδ T细胞免疫疗法可能通过对于适应性免疫的固有协调实现肿瘤的长期缓解。例如，γδ T细胞与疫苗免疫的建立有关。另外，在接触性超敏反应和感染中，高质量记忆性CD8+T细胞的建立是γδ T细胞依赖的，这可能也存在于肿瘤中。因此，γδ T细胞免疫疗法不应仅仅视为αβ T细胞治疗失败的替代品，而应是αβ T细胞治疗的佐剂。这再次强调γδ T细胞免疫疗法在宿主排斥前可能保留迅速重启宿主适应性免疫的固有能力。

总结：

γδ T细胞在连接固有免疫和适应性免疫应答的独特能力使其成为治疗肿瘤的明星候选细胞。目前，γδ T细胞的临床实验正在火热进行中。γδ T细胞治疗具有良好的安全性，且与ICB联合治疗具有更好的治疗效果。

好的研究成就好的药物。药物开发需要整合基础研究、实验医学、药物科学和试验设计的结果。我们的目标是开发有效、便宜和方便的药物，在充分安全的条件下使不同肿瘤的多种群患者受益。当我们克服αβ T细胞的限制时，我们也应该认识到TME中γδ T细胞的抑制机制，进而鉴定更多的治疗靶点。庆幸的是，目前的研究如火如荼，我们有充分的理由保持乐观。

综上所述，这篇综述总结γδ T细胞在治疗肿瘤中的独特生物学特性和相关临床试验，并探讨γδ T细胞在临床应用中的相关前景与思考。

原文链接：https://doi.org/10.1126/science.abq7248

制版人： 十一

参考文献

1. Bruno, Silva-Santos., Sofia, Mensurado., Seth B, Coffelt.(2019). γδ T cells: pleiotropic immune effectors with therapeutic potential in cancer.Nat Rev Cancer, 19(7), 0. doi:10.1038/s41568-019-0153-5

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